На форуме проводятся технические работы

IPB

Здравствуйте, гость ( Вход | Регистрация )

 
Reply to this topicStart new topic
> Клеточная терапия в неврологии
Гость_Garry_*
сообщение 25.07.2006, 13:01
Сообщение #1





Гость






Клеточная терапия в неврологии

Введение

Под клеточной терапией неврологических заболеваний подразумевается использование клеток как нейронального, так и другого происхождения, для замещения, восстановления или улучшения функции поврежденной нервной системы. Этот метод также называется нейротрансплантацией; обычно трансплантируют выделенные клетки, которые иногда могут быть генетически модифицированы. Тканевая инженерия нервной системы – это наука проектирования, создания и реализации систем, в которых нервные клетки организованны определенным образом, и которые могут применяться для решения соответствующих диагностических, паллиативных и терапевтических задач, относящихся к нервной системе.
Заболевания нервной системы - это самая распространенная проблема, требующая медицинского обслуживания в Западном полушарии. Затраты на заболевания ЦНС в индустриализованном мире, учитывая, что для большинства необходимо длительное лечение, в совокупности с психиатрическими заболеваниями, по числу госпитализаций и продолжительности лечения превосходит почти все другие заболевания, вместе взятые. Для лечения этих заболеваний существует мало эффективных методов. Травма или болезнь ЦНС почти всегда приводят к некоторым формам умственного, физического или поведенческого расстройства, появляющегося как результат гибели, дегенерации или дисфункции нейронов. Хотя в человеческом мозге существует миллиарды нервных клеток, к деструктивным симптомам может привести потеря всего лишь полмиллиона клеток в критической области мозга. В большинстве органов и тканей взамен погибших из-за болезни или травмы клеток образуются новые. Напротив, большинство нервных клеток сформировано до или вскоре после рождения, а дифференцированные клетки взрослой центральной нервной системы не способны делиться и образовывать новую нервную ткань. Постоянная потеря нейронов в результате болезни или травмы формирует неврологический и психологический дефицит и приводит к проявлению первых симптомов заболевания. Поэтому цель клеточной терапии - замещение утраченных нейронов или восстановление их функций.

Типы клеток, использующихся для лечения неврологических болезней

Для имплантации в нервную систему могут быть использованы различные типы клеток:

· Аутологичные макрофаги
· Активированные Т лимфоциты
· Глиальные клетки
· Эндотелиальные клетки мозга
· Фетальная ткань
· Нейрональные стволовые клетки
· Стволовые клетки костного мозга
· Нейрональные прогениторные клетки
· Стволовые клетки из ольфакторного нейроэпителия
· Ксенотрансплантаты
· Иммортализированные клетки

Нейроны и олигодендроциты являются терминально дифференцированными клетками. Это значит, что, однажды дифференцировавшись из клетки-предшественника, они не могут пролиферировать. Прямое следствие такой дифференцировки – то, что в области, где нейродегенеративное заболевание приводит к гибели нейронов и олигодендроглии, восстановление клеток невозможно.
Было показано частичное восстановление моторной функции после имплантации предварительно простимулированных для регенерации нерва аутологичных макрофагов в полностью перерезанный спинной мозг взрослой крысы (Schwartz et al 1999a). Предполагаемый механизм действия – стимуляция событий, естественно происходящих в спонтанно регенерирующих системах. Наибольшее значение для трансплантации имеют фетальные ткани и стволовые клетки.

Активированные Т-лимфоциты

Ключевым моментом в восстановлении поврежденных тканей является процесс привлечения и активации иммунных клеток, который отсутствует или недостаточен в ЦНС. Это дает основание предложить разработку метода терапии иммунными клетками, при котором поврежденная ЦНС в нужном количестве обеспечивается должным образом активированными экзогенными иммунными клетками, например, Т-лимфоцитами. При таком способе контроля удается получить максимальный положительный эффект с минимальным риском болезни (Schwartz et al 1999b). Ожидается, что такие саморегулирующиеся клетки смогут общаться с поврежденной тканью, следить за ее потребностями и контролировать динамику исцеления ЦНС.
Т-лимфоциты способны проникать через гемоэнцефалический барьер и могут быть генетически модифицированы для выработки нейральных факторов роста (NGF). Продукция NGF такими клетками сравнима по количеству с продукцией генетически модифицированных фибробластов. Генноинженерные Т-лимфоциты были использованы как средства доставки NGF через эндотелиальный барьер между нервами и кровью с целью облегчения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (Flugel et al 2001).

Нервные стволовые клетки

Термин "нервные стволовые клетки" применим как к клеткам, которые могут произвести нервную ткань, так и к клеткам, происходящим из нервной системы. Нервные стволовые клетки, однако, неуловимы, поскольку их количество во взрослом мозге порядка 1 на каждые 300 клеток. Существует значительный интерес к идентификации и точному местоположению взрослых нервных стволовых клеток in vivo. Работы, в которых исследовалась локализация нервных стволовых клеток, противоречивы и предполагают два различных местоположения в пределах взрослого мозга: эпендимальный слой, выстилающий желудочки мозга, и субэпендимальный слой, смежный с эпендимой. Было показано, что преобладающий функционирующий тип стволовых клеток существует в перивентрикулярной области взрослого мозга и обладает способностью образовывать нервные и не нервные клетки.

Нейрогенез из эмбриональных стволовых клеток

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) способны дифференцироваться in vitro в клетки эндодермального, мезодермального и эктодермального типа, но спонтанное развитие нейрональных клеток из них довольно ограничено. Поэтому для увеличения выхода нейрональных клеток были разработаны специальные протоколы, например, индукция дифференцировки в нейрональные клетки ретиноевой кислотой (РК) и отбор их линий. Высокие концентрации РК приводят к эффективной нейрональной дифференцировке, сопровождающейся экспрессией тех же тканеспецифичных генов, белков, ионных каналов и рецепторов, которая происходит при естественном развитии и так же контролируется. Поскольку выживаемость и способность к развитию РК-индуцированных нервных клеток ограничена, были установлены специфические протоколы дифференцировки в нейрональном направлении, использующие факторы роста и внеклеточного матрикса (Guan et al 2001). После формирования клеток трех первичных зародышевых листков мезодермальная дифференцировка была ингибирована удалением сыворотки, а предшественники нервных клеток были получены путем добавления в среду культивирования основного фактора роста фибробластов и индуцирующих нейрональную дифференцировку факторов. Дальнейшее применение увеличивающих выживаемость факторов, таких как нейротрофические факторы и цитокины, на конечных стадиях привело к существенному увеличению количества, улучшению выживания и сохранения дофаминергических нейронов. В будущем эти клеточные системы могут применяться: (1) для изучения определения нейрональной специфичности in vitro, (2) для фармакологической оценки при скрининге лекарств и (3) для отбора дифференцированных нервных клеток, которые могут использоваться в качестве источника клеточных и тканевых трансплантатов. Сочетание молекулярных диагностических технологий, например, кДНК микроматриц, белковых чипов и последовательного анализа экспрессии генов (SAGE) с системами нейрональной дифференцировки позволило бы обнаруживать, выделять и характеризовать специфическую экспрессию генов, вовлеченных в нервную дифференцировку.
Запатентованный Curis продукт hedgehog, маленькая молекула, которую можно вводить перорально, способна индуцировать дифференцировку мышиных ES-клеток в моторные нейроны при активации hedgehog-путей стволовых клеток (Wichterle et al 2002). Это имеет важное значение для лечения такой болезни, как боковой амиотрофический склероз, при котором поражены моторные нейроны.

Преобразование нервных стволовых клеток в другие типы клеток

Нервные стволовые клетки могут быть выделены из более примитивной ткани, которая также обладает способностью производить стволовые клетки и других тканей. После трансплантации облученным реципиентам генетически меченных нервных стволовых клеток из этих клеток могут получиться разнообразные типы клеток крови, в том числе миелоидные и лимфатические клетки, также как и ранние гемопоэтические клетки, что дало начало выражению "превращение мозга в кровь". Одно исследование показало, что процесс дифференцировки нервных стволовых клеток проходит при пространственно управляемом подавлении транскрипционых генов-репрессоров (Muhr et al 2001). Это открытие противоречит классическому представлению, что клетки развиваются в определенных направлениях, следуя положительным индуктивным сигналам. Понимание этого процесса позволит контролировать популяции стволовых клеток in vitro для клинического применения в трансплантологии.

Нейрональные прогениторные клетки

Зигота тотипотентна (имеет неограниченную способность специализироваться во все ткани), но не самообновляется. Во взрослом человеческом головном мозге есть нейрональные прогениторные клетки (нервные клетки-предшественники). Нервные стволовые клетки мультипотентны (имеют способность давать начало большинству тканей организма), но самообновляются. По мере того, как они становятся нервными прогениторами, их самообновление ограничивается. Во взрослом человеческом мозге были идентифицированы и нейрональные, и олигодендроглиальные предшественники, и были разработаны методы их выделения и обогащения. В ЦНС мультипотентные стволовые клетки дают начало различным видам специфических предшественников, которые делятся ограниченное число раз прежде, чем терминально дифференцируются или в нейроны, или в глиальные клетки. Однако одно исследование показало, что определенные внеклеточные сигналы могут побудить олигодендроглиальные клетки-предшественники к возврату к мультипотентным нейрональным стволовым клеткам, которые могут самообновляться и давать начало нейронам и астроцитам, так же как и олигодендроцитам. Таким образом, эти клетки-предшественники имеют больший потенциал развития, чем в общем считающийся ограниченным потенциал нервных клеток-предшественников.
Гиппокамп взрослого человека содержит способные к митотическому делению нервные клетки-предшественники, которые возможно селективно выделить. Выделение этих клеток позволит обеспечить клеточный субстрат для репопуляции поврежденного или дегенеративного взрослого гиппокампа. Выделенные из взрослого гиппокампа стволовые клетки по способности к развитию в функциональные нейроны центральной нервной системы сходны с клетками развивающегося мозга (Song et al 2002). Типичные синаптические структуры взрослых стволовых клеток были связаны с дендритами, аксонами и телами клеток. Взрослые клетки не только внешне выглядят как дифференцированные, но и вписываются в нервную сеть и получают синаптические импульсы от других нейронов. Это исследование показывает, что нервные стволовые клетки, полученные из взрослых тканей, также как и полученные из эмбриональных тканей, сохраняют потенциал дифференцировки в функциональные нейроны со специфическими свойствами зрелых нейронов ЦНС. Исследование факторов, управляющих судьбой взрослых нервных стволовых клеток, показывает, что астроциты, роль которых обычно считается ограниченной главным образом поддерживающей нейроны матрицей, способны давать стволовым клеткам инструкции, направляющие их развитие в нейроны (Svendsen 2002). Это неожиданный результат, потому что большая часть нейронов образуется в течение эмбрионального развития прежде, чем появляются большинство астроцитов.
Нервные клетки-предшественники широко распространены во всех отделах взрослой центральной нервной системы (ЦНС), но дают начало нейронам только в определенных местах. Окись азота (NO) действует как важный отрицательный регулятор пролиферации клеток взрослого мозга млекопитающих, и NO управляет делением нервных стволовых клеток во взрослом мозге (Packer et al 2003). Это может сформировать основу стратегии увеличения нейрогенеза во взрослой центральной нервной системе. В поддержку этого свидетельствует:

· производство NO в мозге крысы подавляется внутрижелудочковым вливанием ингибитора NO-синтазы.
· у линейных мышей с нокаутированным геном нейрональной NO-синтазы число вновь образованных клеток в нейрогенных областях взрослого мозга сильно увеличено.

В настоящее время распространено мнение, что все клеточное разнообразие мозга происходит не от одного типа универсальной стволовой клетки, а от многих различных типов "мультипотентных" стволовых клеток ЦНС, каждый из которых дифференцируется в определенные типы нейронов, выполняющих разные функции.
Взрослые мультипотентные предшественники нервных клеток должны сделать выбор между самообновлением и дифференцировкой в нейроны, олигодендроциты или астроциты. В этом решении стволовой клетки важную роль играет модификация хроматина, потому что таким образом может одновременно контролироваться экспрессия многих генов. Вальпроевая кислота (VPA), ингибитор гистондеацетилазы (HDAC), в гиппокампе индуцирует нейрональную дифференцировку взрослых нервных клеток-предшественников и ингибирует их дифференцировку в астроциты и олигодендроциты. Было обнаружено, что один из генов, чья экспрессия повышается под воздействием VPA, - NeuroD, основной нейрогенный фактор транскрипции (neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor, NeuroD). Повышенная экспрессия NeuroD приводит к стимуляции нейрональной и подавлению глиальной дифференцировки. Эти результаты говорят о том, что VPA содействует нейрональному определению судьбы клеток и одновременно препятствует глиальному определению посредством индукции нейрогенных факторов транскрипции, включая NeuroD. Глубокое влияние VPA на стимуляцию нейрональной и ингибицию глиальной дифференцировки означает, что сохранение ацетилированного состояния, как показывает ингибиция HDAC, может иметь общее и преобладающее влияние на развитие нейрональной дифференцировки. В будущих исследованиях должен быть определен точный порядок и связь модификации хроматина и регуляции экспрессии генов в управлении определением судьбы взрослых мультипотентных клеток-предшественников.

Развитие стволовых клеток ЦНС человека

Стволовые клетки взрослого головного мозга подобны стволовым клеткам костного мозга, и процесс их развития называется нейропоэз. Некоторые особенности нервных клеток-предшественников делают их идеальным средством для восстановления мозга. Их можно клонально размножить в культуре, обеспечив возобновимый запас материала для трансплантации. Единственная нервная стволовая клетка способна производить различные типы клеток центральной нервной системы, в том числе нейроны, астроциты и олигодендроциты. Было показано, что нейральные прогениторы могут быть получены из мозга посмертно, а также прижизненной биопсии, причем наибольшее количество – из гиппокампа и вентрикулярной зоны (Palmer et al 2001). Нейроны спонтанно образуются на всех стадиях, но более полная дифференцировка клеток наблюдается при замене факторов роста форсколином и ретиноевой кислотой. Дальнейшие работы в этой области могут создать альтернативу эмбрионам в качестве источника стволовых клеток.
В субвентрикулярной зоне ювенильного и взрослого головного мозга существуют нейральные стволовые клетки с характеристиками астроцитов. Эти клетки создают большое количество новых нейронов, которые мигрируют через ростральный путь к обонятельной луковице. Недавние исследования показали, что эти нейральные стволовые клетки не только служат предшественниками многим нейронам и глиальным клеткам вскоре после рождения, но и дают начало взрослым SVZ клеткам, которые продолжают производить нейроны в течение взрослой жизни (Merkle et al 2004). Эта работа также позволила разработать метод генетической модификации связей между неонатальными и взрослыми стволовыми клетками.
Взрослые клетки головного мозга имеют ограниченную способность мигрировать в место повреждения и участвовать в регенерации. Поскольку взрослые дифференцированные нейроны в норме не делятся ни в головном мозге, ни в культуре, усилия были направлены на получение нормальных нейронов из нейрональных предшественников. Метод, позволяющий обойти эти ограничения – трансплантация человеческих нейральных стволовых/прогениторных клеток, поскольку эти клетки могут как мигрировать, так и становиться клеточными компонентами нервной системы. Преимущества использования стволовых клеток костного мозга:

· Получение этих клеток – безопасная процедура, делающая ненужной рискованную операцию получения стволовых клеток из головного мозга
· Успешное применение взрослых стволовых клеток устраняет нужду в фетальных тканях, освобождая от множества этических проблем
· Применение аутологичных клеток костного мозга исключает введение чужеродных клеток и необходимость токсичных средств иммуносупрессии, предотвращающих отторжение
· Быстрый рост и самообновление в культуре обеспечивают действительно неограниченный источник клеток и устраняют необходимость в иммортализации и возможность опухолеобразования.

Механизм миграции нервных стволовых клеток в места повреждения ЦНС

Нервные стволовые клетки (НСК) мигрируют на большие расстояния через паренхиму по нестереотипическим путям в точном направлении к местам повреждений ЦНС, где они могут подвергаться действию выделяемых микроокружением (нишей) локальных кратковременно экспрессируемых репаративных сигналов. Показано, что воспалительный ответ направляет поведение потенциально репаративных клеток (Imitola et al 2004). Человеческие НСК in vivo мигрируют (в том числе из противоположного полушария) к области инфаркта (пример повреждения ЦНС), где локальные астроциты и эндотелий выделяют повышенные количества воспалительного хемоаттрактанта - фактора стромальных клеток 1a (stromal cell-derived factor 1a (SDF-1a)). НСК экспрессируют СХС хемокин рецептор 4 (CXCR4), это рецептор для связывания SDF-1a. Воздействие SDF-1a на покоящиеся НСК усиливает их пролиферацию, активизирует цепь их миграции и трансмиграции, активирует молекулярные пути, опосредующие их вовлечение в процессы репарации. Блокада CXCR4 отменяет управляемую патологией цепь их миграции, важный в эмбриональном развитии способ тангенциальной миграции, что в совокупности может объяснить хоминг по нестереотипическим путям. Эти данные о SDF-1a/ CXCR4 – пример того, как воспалительная среда, характеризующая многие патологии, действует в качестве пути активации молекулярных программ НСК при повреждении. Это говорит о том, что воспаление играет не только неблагоприятную роль, но и обеспечивает химические стимулы, привлекающие стволовые клетки, обладающие регенеративной поддерживающей гомеостаз способностью. Экспрессия CXCR4 в герминальных зонах говорит о том, что хоминг НСК после повреждения и их миграция во время эмбрионального развития могут осуществляться по сходным механизмам.

Стволовые клетки обонятельного эпителия для трансплантации в ЦНС

Расположение стволовых клеток во взрослой ЦНС делает практически невозможным их хирургическое получении для аутологичной трансплантации. Еще больше ограничивают возможности их применения их труднодоступность и проблемы гистосовместимости. Напротив, обонятельный нейроэпителий, выстилающий обонятельную область носа, обладает способностью к постоянной регенерации и его биопсия легко выполнима. Стволовые клетки были выделены из обонятельного эпителия человеческих трупов (Roisen et al 2001). Эти клетки сохраняли жизнеспособность в течение 16 месяцев и могут в условиях лаборатории проходить 100 или больше циклов клеточного деления. Размножение ex vivo этих клеток может обеспечить пациент-специфичную популяцию клеток для проведения иммунологических, генетических и фармакологических исследований. Долговременная цель – определить пригодность этих клеток для содействия восстановлению ЦНС. Стволовые клетки из обонятельного нейроэпителия развиваются в нейроны или в миелин, что делает их потенциальными компонентами лечения болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона или рассеянного склероза и травм спинного мозга. Пройдет по меньшей мере еще пять лет, прежде чем эти методы лечения смогут испытываться на людях.

Получение клеток ЦНС из стволовых клеток ненервного происхождения


Предшественники нейронов – плюрипотентные стволовые клетки, которые могут быть получены их различных источников как в ЦНС, так и вне нее, а также из коммитированных предшественников, которые, вероятно, встречаются только в ЦНС. Такие клетки обычно получают от незрелых животных, сохраняют и размножают in vitro и используют для экспериментальных трансплантаций, цель которых – заместить нейроны и миелинизирующие клетки. Нейроны могут быть получены из гемопоэтических стволовых клеток или даже из взрослых стволовых клеток жировой ткани.
Стволовые клетки костного мозга (СК КМ) как человека, так и грызунов, могут быть индуцированы к дифференцировке в нервные клетки при определенных условиях экспериментальной культуры клеток (Sanchez-Ramos et al 2000). Культивируемые в присутствии таких факторов роста, как EGF или BDNF, СК КМ экспрессируют мРНК нестина и сам этот белок, являющиеся маркерами нейральных предшественников. Такие культуры также экспрессируют кислый глиальный фибриллярный белок и нейрон-специфичный ядерный белок. Микроокружение регенерирующего спинного мозга куриного эмбриона стимулирует дифференцировку значительной части взрослых человеческих ГСК в полностью развившиеся нейроны (Sigurjonsson et al 2005). Это может открыть новые возможности для получения больших количеств нейронов из собственного костного мозга пациента.
Исследователи из Медицинского центра университета Дюка (Duke University Medical Center (Durham, NC)) получили нервные клетки из стволовых клеток жировой ткани (Safford et al 2002). Опыты проводились параллельно на человеческих и мышиных клетках. И мышиные адипоциты, и полученные при процедуре липосакции человеческие жировые клетки обрабатывали специальными химическими веществами и факторами роста и выращивали в лаборатории. В обоих случаях в течение нескольких часов обработанные клетки начинали выглядеть как нервные клетки и вырабатывать измеримые количества белков, в норме экспрессируемых нервными клетками. Через два года после того, как из человеческих жировых клеток было получено то, что представлялось нервными клетками, та же группа исследователей из Duke University Medical Center сделала следующий шаг для демонстрации того, что эти новые клетки и работают подобно нервным клеткам (Safford et al 2004). Используя смесь ростовых факторов и индуцирующих агентов, исследователи преобразовали полученные из мышиной жировой ткани клетки в нейроны и глиальные клетки. В начале 2005 года группа из университета Дюка продемонстрировала, что эти полученные из жировой ткани клетки действительно являются взрослыми стволовыми клетками. В будущем станет возможным получать клетки из практически неисчерпаемого источника – жира – и «переобучать» их для дифференцировки по новым путям развития. В более поздних экспериментах исследователи показали, что трансформированные из жировых клетки экспрессируют многие белки, сходные с теми, которые экспрессируются в нормальных нервных и глиальных клетках. Более того, они показали, что функции этих клеток сходны с функциями нервов. Эти индуцированные клетки жировой ткани демонстрируют эксцитотоксичный ответ на Н-метил-Д-аспартат (N-methyl-D-aspartate (NMDA)), что соответствует утрате жизнеспособности клеток, и это говорит о том, что эти индуцированные клетки сформировали функционирующие рецепторы к NMDA, подобные тем, что находятся на поверхности нервных клеток. Недавние исследования показали, что активация глутаматом рецепторов к NMDA может вызвать раннюю транскрипцию генов в развитии нейронов, так же как и определить степень нейрональной пролиферации в головном мозге. Это наводит на мысль о том, что характеристики этих индуцированных клеток сходны с характеристиками развивающейся нервной ткани. Эти открытия являются основой для последующих работ с жировой тканью в качестве реального ресурса для клеточной терапии. Следующим шагом будет определить, как ведут себя эти клетки, будучи имплантированными в живое животное. Затем такие клетки можно будет использовать для лечения многих болезней центральной и периферической нервной системы человека.

Иммортализированные клетки для лечения болезней ЦНС

В настоящее время иммортализированные клеточные линии имеют наилучшую перспективу получения из них клеток, которые реально могут быть использованы в качестве терапевтических агентов; в то время как стволовые клетки пока еще остаются на стадии эксперимента. Во множестве работ сообщается, что иммортализированные нервные клетки-предшественники могут должным образом встраиваться в головной мозг млекопитающих, могут стабильно экспрессировать привнесенные в них гены и компенсировать дефицит функций на различных животных моделях неврологических заболеваний. Примеры экспериментального использования иммортализированных клеток для лечения болезней ЦНС приведены в таблице.

Таблица. Экспериментальное использование иммортализированных клеток для лечения болезней ЦНС

Иммортализирован-ные клетки Модификация/метод Применение/результаты
Подобные стволовым нервные клетки, полученные из мозжечка (С17-2) Имплантировались в различных мышиных моделях неврологических дисфункций Замена пораженных клеток (нейроны/олигодендроглия)
Клетки С17-2 При рождении инъецировались в мозговые желудочки мышам с демиелинизирующей болезнью Замещение нефункционирующих олигодендроцитов клетками, экспрессирующими основной белок миелина
Нервные стволовые клетки При помощи вирусного вектора генетически модифицированы для экспрессии способствующих восстановлению нервной ткани факторов, например, нейротрофических факторов и нейротрансмиттеров Лечение нейродегенеративных заболеваний
Нервные стволовые клетки Ретровирально трансдуцированы для продукции нервных ростовых факторов и трансплантированы в поврежденный головной мозг Заметное улучшение когнитивных и нейромоторных функций и сохранение СА3 нейронов гиппокампа в течение острого посттравматического периода (Philips et al 2001).
Нейроэпителиальные стволовые клетки Кондиционная иммортализация стволовых клеток головного мозга при внесении в них иммортализирующего онкогена Компания ReNeuron Ltd разрабатывает эту линию для лечения инсульта, болезни Паркинсона, хореи Гентингтона и церебрального паралича
Нервные клетки-предшественники Генетически модифицированы для экспрессии нейротрофических факторов и метаболических ферментов и имплантированы Использовались в животных моделях ослабления памяти, сходных с болезнью Альцгеймера
Клетки черной субстанции Генетически модифицированы для экспрессии дофамина и дигидроксифенилаланина и имплантированы Некоторая компенсация дефицита при моделируемой на приматах болезни Паркинсона
Хромаффиновые клетки надпочечников Могут сохранять фенотип первичных хромаффиновых клеток in vitro в течение длительных периодов времени и способны выделять нейроактивные молекулы Возможность нового подхода к лечению боли (Eaton et al 2000).


Трансплантация фетальной ткани

Человеческая фетальная нервная ткань может быть использована для трансплантации в стриатум пациентам с болезнью Паркинсона. Ограничивают применение этого метода этические факторы, в том числе проблема получения человеческой фетальной ткани, и необходимость иммуносупрессии для выживания трансплантированной ткани. Альтернатива – использование нервных стволовых клеток, которые перед трансплантацией в ЦНС могут пролиферировать в культуре под воздействием основного фактора роста фибробластов. Они могут дифференцироваться как в глиальные, так и в нейрональные клетки для замещения нейронов, дегенерирующих при болезнях Альцгеймера и Паркинсона. Отвечающие на эпидермальный фактор роста стволовые клетки ЦНС при трансплантации в постнатальный спинной мозг могут также развиваться в олигодендроциты. Воздействие на стволовые клетки ЦНС комбинацией различных трофических факторов может привести к более успешному приживлению трансплантата. Согласно результатам исследования, проведенного компанией Lundbeck ASand Cepahalon Inc, полусинтетический состав CEP-1347 защищает различные типы нервных клеток от запрограммированной клеточной смерти (апоптоза), к которой приводят различного рода инсульты, и может улучшить выживаемость фетальных дофаминэргических нейронов до и после трансплантации. СЕР-1347 значительно увеличивает выживаемость трансплантированных крысиных дофаминэргических нейронов, обработанных им до и после трансплантации. По сравнению с необработанными нейронами, выживаемость обработанных СЕР-1347 трансплантированных дофаминэргических нейронов по крайней мере на 300% больше. СЕР-1347 – средство для перорального приема, избирательный и мощный ингибитор активируемого стрессом протеин-киназного пути, внутриклеточного сигнального пути, являющегося принципиально важным компонентом ответа на стресс, приводящим к смерти нейронов. Компания завершила 1 фазу клинических испытаний СЕР-1347 и в начале 2005 года приступила к пилотным испытаниям 2 фазы у пациентов с болезнью Паркинсона.
Преимущества трансплантации в головной мозг первичной фетальной ткани – восстановление функций и подтвержденный эффект. Недостатки – ограниченность ресурсов, критический фактор времени для получения и тестирования ткани и отсутствие миграции клеток трансплантированной ткани. Кроме того, существуют некоторые этические проблемы, которые должны быть разрешены.
Основания для оптимизма по поводу будущего использования трансплантаций фетальных стволовых клеток для лечения неврологических болезней дает утверждение Рона Мак-Кея, заведующего лабораторией молекулярной биологии Национальных Институтов здоровья США (Ron McKay, chief of the Laboratory of Molecular Biology at the US National Institutes of Health (Bethesda, Maryland, USA)). Докладывая 20 июня 2001 года о результатах своих работ со стволовыми клетками на лондонской встрече Всемирной Федерации Неврологии (World Federation of Neurology meeting in London, UK), он утверждал, что человеческие нервные стволовые клетки из фетальной ткани могут быть в больших количествах размножены in vitro прежде чем они созреют до состояния выделяющих дофамин нейронов. До сих пор в клинических испытаниях приходится полагаться на донорские ткани от двух-четырех фетусов для каждого пациента, чтобы получить достаточное число клеток. Теперь единственный фетус может обеспечить достаточное количество материала для одного или более пациентов с болезнью Паркинсона. По утверждению Олле Линдвалла, профессора неврологии в университете Лунда в Швеции, число клеток играет ключевую роль в успехе лечения. Чтобы обеспечить необходимый для заметного клинического эффекта минимум клеток – 100-150 тысяч выделяющих дофамин нейронов – нужно от двух до четырех фетусов-доноров. Но для улучшения выживаемости клеток и эффективности трансплантации для каждого пациента требуется в пять или десять раз больше материала.
В Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины (Харьков) изучали особенности коррегирующего действия трансплантации нативных и криоконсервированных фетальных нервных клеток (нФНК и кФНК) на лимфогемопоэтический комплекс (ЛГПК) и центральную нервную систему (ЦНС) животных с аллергическим энцефаломиелитом (ЭАЭ). На пике развития патологии (21 сутки ЭАЭ) на уровне пояснично-крестцовых сегментов отмечали очаги воспаления, инфильтрованные мононуклеарными клетками с разрушением миелиновой оболочки аксонов. В этот же срок в селезенке наблюдалось увеличение количества и размеров лимфоидных фолликулов. В центрах размножения определялась повышенная митотическая активность лимфобластов, число которых вместе с фагоцитирующими клетками увеличивалось. В отдаленные сроки после введения ФНК как на 7, так и 14 сутки ЭАЭ отмечено затухание явлений воспаления, уступающее место пролиферативной активности глии в виде рыхлых и более плотных узелков. Тенденция к восстановлению структуры селезенки наблюдалась лишь на 14-е сутки после введения ФНК, и выражалась снижением размеров реактивных центров фолликулов и отсутствием плазматических клеток в красной пульпе. Существенное влияние трансплантация ФНК оказывала на состояние иммунной системы реципиентов. Отмечено, что кФНК коррегировали содержание обеих субпопуляций Т-клеток на 14-е и несколько менее выражено на 7 сутки патологии, тогда как нФНК обладали такой способностью лишь при введении на 14 сутки. Выраженное снижение ЕК-активности спленоцитов до уровня контроля отмечено при введении ФНК только на 14 сутки патологии (Гольцев и др. 2005).

Лабораторные мыши с клетками человеческого головного мозга

Исследователи из компании Stem Cells Inc в сотрудничестве с учеными из Стэнфордского университета продемонстрировали возможность создания лабораторной мыши с клетками человеческого головного мозга. Калифорнийское исследование включало в себя выделение человеческих стволовых клеток в лаборатории и введение их мыши. По мере взросления мыши из человеческих стволовых клеток, которые могут развиться в клетки любого типа, получается все разнообразие специализированных клеток мышиного головного мозга. Это исследование показало, что стволовые клетки человеческого головного мозга могут быть индуцированы к росту и развитию внутри мышиного черепа. Это новый этап в развитии клеточной терапии неврологических заболеваний, но он подлил масла в огонь споров об этике в биоинженерии. Компания разъяснила, что целью этой работы было не воссоздание человеческого мозга, а понимание того, как функционируют стволовые клетки и как они могут быть использованы для лечения определенных болезней. Следующим этапом могло бы быть создание мыши, чей мозг содержит определенную долю человеческих клеток. Исследователи считают, что такую мышь можно будет использовать для проверки методов лечения человеческих болезней головного мозга, например, болезней Паркинсона и Альцгеймера, хотя такие проверки пока еще не проводились.

Нейросферы

«Нейросферой» называют гетерогенную смесь мультипотентных стволовых клеток с популяциями клеток-предшественников с более ограниченными возможностями. Нейросферы также могут быть получены из эмбрионального человеческого головного мозга и в некоторых случаях в течение долгого времени могут выращиваться в культуре. Полученные из эмбриональной, неонатальной или взрослой центральной нервной системы грызунов клетки под воздействием эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF-2) делятся, сохраняя способность дифференцироваться в нейроны и клетки глии. Было показано, что введение нейротрофического фактора увеличивает число нейронов, образующихся в условиях бессывороточной среды (Caldwell et al 2001). Наиболее сильный эффект дают нейротрофические факторы 3 и 4 (NT3, NT4) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF); их действие основано скорее на увеличении выживаемости клеток, чем на индукции нейронального фенотипа. После дифференцировки нейроны могут пережить диссоциацию и перемещение или трансплантацию в головной мозг взрослой крысы. Эта экспериментальная система обеспечивает почти неограниченный источник, богатый генетически неизмененными нейронами. Он может быть использован как для скрининга in vitro действующих на нейроны лекарственных средств, так и для потенциальной клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний.

Идеальные клетки для трансплантации в нервную систему

Желательные свойства клеток для трансплантации в центральную нервную систему:

1. Их должно быль легко получить. Все клетки, упомянутые в предыдущем разделе, достаточно доступны.

2. Предпочтительны аутологичные клетки пациента, но в настоящее время от пациента могут быть получены только аутоиммунные Т-лимфоциты, стромальные клетки костного мозга и фибробласты.

3. Должна быть возможность культивировать, размножать и сохранять клетки in vitro. Это необходимо, чтобы получить большое количество клеток, требующееся для трансплантации и гарантировать гомогенность популяции при высоких стандартах качества. Этим требованиям отвечают все перечисленные клетки-кандидаты.

4. Должна быть возможность генетической модификации клеток, чтобы они экспрессировали терапевтические гены, улучшающие микроокружение трансплантата и способствующие регенерации. Этим требованиям отвечают все перечисленные клетки-кандидаты. Поскольку это пролиферирующие клетки, их можно модифицировать при помощи ретровирального вектора. В настоящее время для генной терапии вне организма применяются только генетически модифицированные фибробласты и стромальные клетки костного мозга, тогда как возможности модификации других клеток для продукции ими биологически активных молекул все еще изучаются.

5. При трансплантации клеток не должна требоваться иммуносупрессия для предотвращения отторжения. Нервные стволовые клетки являются отчасти иммунопривилегированными, поскольку они не экспрессируют молекул MHC класса II, в норме находящихся на циркулирующих лейкоцитах. Большая часть трансплантируемых тканей, даже эмбриональная нервная ткань, имеют в своем составе микроглию и другие клетки, которые могут функционировать как циркулирующие лейкоциты. Глаза и головной мозг являются иммунопривилегированными местами, что делает их менее подверженными отторжению клеточных трансплантатов и устраняет необходимость в иммуносупрессантах.

Применение клеточных технологий в неврологии

Технология переноса клеточного ядра в изучении бокового амиотрофического склероза

В феврале 2005 года Рослин Институт (Roslin Institute (Edinburgh, Scotland)) и Королевский Колледж (King’s College (London, UK)) получили лицензию Комитета по вопросам оплодотворения человека и эмбриологии (UK's Human Fertilisation and Embryology Authority) на применение технологии переноса ядра клетки для изучения болезни моторных нейронов (бокового амиотрофического склероза (БАС)). Это даст возможность исследователям создавать линии стволовых клеток из эмбрионов, полученных при использовании ДНК пациентов с БАС, и сосредоточить внимание на пациентах, болезнь которых не может быть связана с генами, которые уже идентифицированы как причина БАС. Сначала стволовые клетки могут быть получены при выращивании в культуре клеток кожи или крови пациентов. Затем ядром одной из этих клеток заменяется ядро неоплодотворенной яйцеклетки, которая после этого выращивается до стадии «200 клеток». Затем применяются факторы роста, чтобы направить полученные из этого эмбриона стволовые клетки к дифференцировке в моторные нейроны. Этот метод дает ученым уникальную возможность исследовать случаи дегенерации нейронов у пациентов с БАС, у которых не было предварительно обнаружено генетического дефекта. Поведение и химические характеристики нейронов будут сравниваться с таковыми нейронов с известным генетическим дефектом, чтобы изучить ранние события, в конечном итоге приводящие к смерти нейронов. Культивируемые нейроны также будут использоваться для проверки, могут ли новые лекарства остановить или обратить развитие болезни.

Препарат стволовых клеток для лечения болезней ЦНС

Стволовые клетки, представляющие собой клоногенные клетки, обладающие свойствами самообновления и многолинейной дифференцировки, имеют возможность замещать или восстанавливать поврежденные ткани. Ученые компании StemCells Inc напрямую выделили клоногенные стволовые клетки человеческой центральной нервной системы из свежей ткани человеческого фетального головного мозга, используя антитела к клеточным поверхностным маркерам и прибор для флуоресцентной сортировки клеток (Uchida et al 2000). Потомство этих клоногенных клеток может дифференцироваться как в нейроны, так и в глиальные клетки. При трансплантации в головной мозг иммунодефицитной новорожденной мыши эти клетки продемонстрировали потенциал к приживлению, пролиферации, миграции и нейральной дифференцировке. Это надежный и воспроизводимый способ отбора единичных самообновляющихся клеток из свежей ткани, так что каждая клетка может произвести множество самообновляющихся дочерних клеток, которые долгое время можно размножать в культуре. Ни у одной из мышей, которым трансплантировали эти клетки, не было обнаружено опухолей, даже при проверке более чем через год после трансплантации. Высоко очищенные нормальные стволовые клетки, которые не были генетически модифицированы онкогенами для обеспечения непрерывного роста, могут быть весьма подходящими для трансплантации и могут обеспечить безопасную и более эффективную альтернативу методам терапии, основанным на применении клеток, полученных из раковых, или неочищенной смеси многих различных типов клеток. Возможность получать стволовые клетки человеческого головного мозга непосредственно из свежей, некультивированной ткани важна по следующим причинам:

· Она обеспечивает источник генетически неизмененных нормальных клеток для трансплантации, не загрязненный другими нежелательными или больными типами клеток.

· Она открывает путь к лучшему пониманию свойств этих клеток и возможностям манипулировать ими для лечения определенных болезней. Например, стволовые клетки из нейральной культуры могут быть генетически модифицированы для секреции необходимых для мозга белков.

· Хорошее приживление этих нетрансформированных нормальных человеческих стволовых клеток в головном мозге мыши-реципиента означает, что на мышиной модели может тестироваться способность этого клеточного продукта корректировать неврологический дефицит при различных человеческих неврологических заболеваниях.

Существуют два метода выращивания нервных стволовых клеток. В одном клетки-предшественники выращиваются на покрытой субстратом поверхности, на которой эти клетки разрастаются монослоем в двумерном микроокружении. Во втором способе клетки выращивают в трехмерном микроокружении на пластике без специального субстрата, и клетки растут кластерами, которые называются нейросферами. Продолжительность жизни этих клеток зависит от сохранения межклеточных контактов во время фазы пролиферации. Продолжительность жизни этих клеток может быть значительно увеличена при добавлении в среду цитокинов, например, ингибирующего лейкемию фактора (LIF). Затем клетки разделяют по размеру методом флуоресцентного клеточного сортинга (FACS). Более крупные клетки позитивно окрашиваются на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), индикатор того, что они являются астроцитами. Только более крупные клетки способны продолжать пролиферацию и при делении in vitro они могут давать как астроциты, так и нейроны. Эмбриональные стволовые клетки in vitro способны развиваться в тирозингидроксилаза-позитивные нейроны. Этот процесс проходит в несколько этапов при добавлении в среду трофических факторов, таких как sonic hedgehog и FGF-8, а также аскорбиновой кислоты. Эти нейроны могут производить потенциал действия (электрическая активность) и могут выделять дофамин, что показывает их потенциальную пригодность для лечения болезни Паркинсона. Хотя из нервных клеток-предшественников может быть получено большое количество нейронов, лишь немногие из них выделяют дофамин. Поскольку ЭСК плюрипотентны, они обладают большей пластичностью, чем нервные стволовые клетки, но при трансплантации в крысиный мозг ЭСК могут приводить к образованию опухолей, тогда как после трансплантации нервных стволовых клеток этого не бывает.

Дифференцировка стволовых клеток в нейроны

Способность изолированных нейрональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных клеток дифференцироваться в нейроны может обеспечить средства для лечения нейродегенеративных болезней и поврежденной в результате травмы нервной ткани. Для такого их применения необходимо разработать методы для идентификации и отбора из всей клеточной популяции нейрональных клеток-предшественников и способы исследования факторов, влияющих на нейрональную дифференцировку.
Команда ученых под руководством д-ра Робина Ловел-Бэджа (Dr Robin Lovell-Badge) в Совете медицинских исследований Национального института медицинских исследований (Medical Research Council's (MRC) National Institute for Medical Research (London, UK)) идентифицировала ген Sox-1, кодирующий один из самых ранних факторов транскрипции, экспрессируемых эктодермальными клетками, коммитированными на нейрональный путь развития. Таким образом, экспрессия этого гена является ранним маркером нейробластической дифференцировки плюрипотентных клеток-предшественников, и, следовательно, анализ на экспрессию этого гена или его продукта может использоваться для идентификации нейробластов в общей популяции клеток.
Ученые показали, что экспрессия Sox-1 играет роль в нейральной детерминации, так как индукция экспрессии этого гена приводит к дифференцировке клеток-предшественников в фибробласты. Можно индуцировать коммитированность этих плюрипотентных клеток к нейральному развитию при помощи трансфекции вектором, управляющим экспрессией Sox-1. Ученые сконструировали линию мышиных эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих поддающийся выявлению маркер под контролем регуляторной последовательности гена Sox-1. Эта клеточная линия может быть использована для скрининга агентов, которые могут индуцировать нейральную дифференцировку, методом наблюдения за увеличением числа клеток, экспрессирующих этот маркер.
Ученые из Geron Corporation показали, что человеческие ЭСК, выращиваемые без фидера в течение более чем 100 удвоений популяции, могут впоследствии дифференцироваться в популяцию клеток с высоким (70-90%) содержанием пролиферирующих нервных клеток-предшественников (Carpenter et al 2001). Клетки этой популяции прогениторов затем дифференцируются в зрелые нейроны, которые демонстрируют функциональные характеристики, сходные с таковыми человеческих нейронов, полученных их фетальной ткани. Некоторые из полученных из ЭСК нейронов экспрессировали тирозингидроксилазу, фермент, определяющий скорость синтеза дофамина. Следующим шагом в разработке полученных из человеческих ЭСК нейронов будут работы по трансплантации их животным с моделями нейродегенеративных заболеваний для демонстрации их пригодности для лечения человеческих неврологических заболеваний.
Замечательный потенциал к развитию и способность к репликации человеческих ЭСК обещают в будущем почти неограниченный источник специфических типов клеток для трансплантационной терапии. Полученные из ЭСК нервные клетки-предшественники могут дифференцироваться in vitro в три типа нервных клеток – астроциты, олигодендроциты и зрелые нейроны. После трансплантации в желудочки мозга новорожденной мыши нейральные прогениторы дают потомство, дифференцирующееся по этим трем линиям в зависимости от того, в каком регионе мозга они находятся (Reubinoff et al 2001; Zhang et al 2001). Эти наблюдения являются этапом, позволяющим при будущем развитии метода получить возможность использовать человеческие ЭСК для лечения неврологических заболеваний.

Человеческие ЭСК для восстановления ЦНС

Исследователи из UC Irvine Reeve-Irvine Research Center описали метод получения большого количества олигодендроцитов и их предшественников из человеческих ЭСК (Nistor et al 2005). Они культивировали ЭСК, стимулировали их дифференцировку в предшественники олигодендроцитов, размножали эти предшественники и затем стимулировали дифференцировку в олигодендроциты, используя позитивную селекцию и механическое обогащение. Трансплантация животным, у которых моделировалась дисмиелинация, привела к интеграции, дифференцировке в олигодендроциты и компактному образованию миелина, что показывает, что эти клетки проявляют функциональный фенотип. Этот протокол дифференцировки дает средство к получению высокоочищенной популяции человеческих олигодендроцитов для использования в исследованиях развития в определенный тип клеток, оценки специфических для олигодендроцитов химических соединений и лечения нейродегенеративных болезней и травматических повреждений взрослой ЦНС.
Ученые из University of Wisconsin (Madison, WI) показали возможность заставить человеческие ЭСК становиться моторными нейронами спинного мозга, ключевой путь, по которому нервная система передает сигналы от головного мозга ко всему остальному организму. Было обнаружено, что для индукции нейроэктодермы к специализации в моторные нейроны требуется ретиноевая кислота, и выдвинуто предположение, что человеческие ЭСК даже на ранних стадиях развития обладают ограниченной способностью дифференцироваться в специфические для отдельных регионов ЦНС нейроны (Li et al 2005). Для дифференцировки в функционирующие моторные нейроны спинного мозга стволовые клетки должны пройти через серию мини-стадий, каждая из которых требует уникальной ростовой среды и точного времени. Сначала из ЭСК образуются нервные стволовые клетки. Затем эти клетки трансформировали в клетки-предшественники моторных нейронов, которые в лабораторных чашках Петри впоследствии развивались в моторные нейроны спинного мозга. Дальнейшие успехи позволят исследователям в будущем создать модельную систему моторных нейронов для скрининга новых лекарств. Новые разработки когда-нибудь смогут помочь жертвам травм спинного мозга или проложить путь для новых методов лечения нейродегенеративных болезней, например, болезни Альцгеймера. Выращивая в лаборатории здоровые нервные клетки, ученые, теоретически, смогут замещать ими погибшие моторные нейроны для восстановления функций и облегчения симптомов неврологических болезней и травм. Ученые из Центра восстановительных биологических наук университета Джорджии культивировали одобренную NIH линию человеческих ЭСК и индуцировали их дифференцировку в моторные нейроны, добавляя в среду bFGF, sonic hedgehog белок и ретиноевую кислоту (Shin et al 2005). На основании характеристик роста и набора экспрессируемых генов дифференцированных клеток ученые установили, что от 20 до 30% клеток демонстрируют фенотип моторных нейронов. Авторы предвидят увеличение этой доли по мере улучшения и отработки своей технологии.

Улучшение роста стволовых клеток в головном мозге при помощи лекарственных средств

Многообещающей для лечения таких нейродегенеративных заболеваний человека, как болезнь Паркинсона, является разработка методов и процедур индукции in vivo массированной пролиферации, направленной миграции и нейродифференцировки в поврежденной взрослой центральной нервной системе. Исследования ученых университета Калифорнии показали, что введение трансформирующего фактора роста альфа (TGF-a, также называемый gfa50) в область повреждения головного мозга крыс стимулирует размножение стволовых клеток и дифференцировку их в многочисленные нормальные полностью развитые нейроны. Вновь образовавшиеся клетки восстанавливали поврежденный головной мозг и устраняли двигательный дефицит у крыс с моделью болезни Паркинсона (Fallon et al 2000). Это открытие может найти ценное применение в разработке методов лечения таких нейродегенеративных болезней, как болезнь Паркинсона. Эти данные предлагают альтернативу применяющейся в настоящее время методике клеточной трансплантации в лечении нейродегенеративных болезней.
Неотрофин (NeoTherapeutics Inc) – производное пурина, индуцирующее продукцию нейротрофических факторов, оказывающих влияние на процессы выживания и дифференцировки нейронов. В преклинических испытаниях лечения болезни Альцгеймера было показано, что неотрофин на 32% увеличивает продукцию стволовых клеток в гиппокампе мыши. Проведенные NeoTherapeutics Inc исследования показали, что под воздействием неотрофина собственные стволовые клетки головного мозга могут созревать в нейроны и астроциты. Неотрофин представляется регенеративным лекарственным средством, которое может повысить ограниченную способность головного мозга к самовосстановлению путем стимуляции продукции новых клеток головного мозга. Однако клинические испытания неотрофина не доказали его эффективности для лечения пациентов с болезнью Паркинсона.
Ученые компании Samaritan Pharmaceuticals Inc в сотрудничестве с университетом Джорджтауна (Georgetown University (Washington, DC)) обнаружили низкомолекулярное вещество, индуцирующее дифференцировку человеческих нейронов из клеток-предшественников, например, оно трансформирует стволовые клетки из эмбриона на ранней стадии развития в состояние взрослых клеток. Используя в качестве модели стволовые клетки человеческой эмбриональной карциномы, ученые отобрали множество небольших молекул по их способности индуцировать нейрональную дифференцировку. По данным биопсии, в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера концентрация одной из этих молекул меньше, чем в мозге здоровых людей соответствующего возраста. Было показано, что эта молекула индуцирует нейрональную дифференцировку, что видно по образованию сетей аксонов и экспрессии маркеров, специфичных для взрослых человеческих дифференцированных нейронов. Было обнаружено, что в отличие от некоторых других молекул, индуцирующих нейрональную дифференцировку, у этой молекулы нет туморогенной активности. В настоящее время она тестируется на животных моделях. Она может быть потенциальным дополнением к лечению нейродегенеративных заболеваний с использованием нервных стволовых клеток.
Недавние исследования впервые показали, что существует эндогенный холинэргический путь управления ангиогенезом и мобилизации собственных стволовых клеток организма. Есть значительная заинтересованность в факторах, подобных ANGIOGENIX (патентованный агонист никотиновых рецепторов от компании Endovasc Ltd), которые хорошо переносятся пациентами и обладают высокой способностью к эффективной стимуляции мобилизации собственных стволовых клеток и клеток-предшественников в организме пациента. Такие открытия могут обеспечить новый способ лечения таких болезней, как приобретенные или врожденные иммунодефициты, ишемические повреждения клеток в результате недостаточного кровоснабжения, стенокардия, повреждения и/или гибель клеток от радиоактивного облучения или химиотерапии.
Стволовые клетки головного мозга, находящиеся в определенных его регионах, нуждаются в активации специфическими молекулярными сигналами, связывающими их с клетками в других регионах. Поэтому может оказаться неэффективным просто трансплантировать стволовые клетки в головной мозг и ожидать, что они будут работать.

Методы введения стволовых клеток в ЦНС

Введение в головной мозг терапевтических субстанций является одной из проблем в лечении заболеваний ЦНС. Главное затруднение при введении лекарственных веществ в ЦНС – преодоление гематоэнцефалического барьера (Jain 2005c). Различные методы введения клеток, которые могут быть использованы при лечении болезней ЦНС, показаны в таблице.

Таблица. Методы введения клеток при лечении заболеваний ЦНС

Имплантация в ЦНС живых клеток, секретирующих лекарственные вещества
Введение лекарственных веществ в специфические точки головного мозга при использовании стереотаксических методов.
Имплантация в ЦНС генетически модифицированных клеток, вырабатывающих лекарственные вещества
Введение через спинномозговую жидкость: интратекально или интравентрикулярно Имплантация в вещество головного мозга
Имплантация в ЦНС «новой ткани»: фетальных клеток, элементов синтетического матрикса и контролируемо выделяющихся белков
Клетки для облегчения преодоления гематоэнцефалического барьера
Активированные генетически модифицированные Т-лимфоциты
Устройства для введения лекарств
Контролируемое введение катетеров для введения клеток в различные части ЦНС
Итратекальная имплантация в спинной мозг инкапсулированных генно-инженерных клеток, секретирующих нейротрофические факторы
Системное внутривенное введение, направленное на головной мозг


Инкапсулированные клетки

Введению в головной мозг потенциально лечебных веществ препятствует гематоэнцефалический барьер, ограничивающий проникновение лекарств из кровотока в паренхиму мозга. Один из способов преодоления этого барьера – использование клеточных имплантов, вырабатывающих и выделяющих терапевтические молекулы (Shoichet and Winn 2000). Инкапсуляция в полимеры, или иммуноизоляция, дает возможность преодолеть этот барьер и вводить терапевтические молекулы непосредственно в нужный регион головного мозга. Метод иммуноизоляции основан на наблюдении, что ксеногенные клетки могут быть защищены от отторжения иммунной системой реципиента при помощи инкапсуляции, или заключения их в иммуноизолирующую полупроницаемую мембрану. Клетки могут быть окружены полупроницаемой мембраной, избирательно пропускающей внутрь кислород и необходимые питательные вещества и позволяющей проходить наружу биологически активным продуктам клеточной секреции, но ограничивающей проникновение крупных цитотоксических агентов защитной иммунной системы реципиента. Такая избирательно проницаемая мембрана устраняет необходимость в постоянной иммуносупрессии реципиента и позволяет имплантировать клетки из ксеногенных источников. Существует обзор методов иммуноизоляции клеток и использования их в преклинических моделях лечения болезни Альцгеймера и хореи Гентингтона (Emerich and Salzberg 2001).
При успешной инкапсуляции клетки сохраняют жизнеспособность и функционируют в течение длительного времени после имплантации. Широко изучается возможность применения для введения терапевтических факторов делящихся клеточных линий. Одна из проблем – тенденция клеток продолжать пролиферацию в ограниченном пространстве внутри капсулы, что приводит к слишком быстрому исчерпанию запасов питательных веществ. Для предотвращения этого разработан метод инкапсуляции ограниченного числа содержащих клетки микроносителей в устройство из полых волокон (Li et al 1999). Контроль пролиферации достигается помещением содержащих клетки микроносителей в немитогенный гидрогель. Пригодность этого метода контроля роста во внутрикапсульном пространстве клеток, в норме быстро размножающихся, была продемонстрирована как in vitro, так и in vivo. Была также показана возможность контролировать количество выделяемого вещества, изменяя его в несколько раз, на инкапсулированных клетках РС-12, выделяющих нейротрансмиттеры, и на мышиных миобластах линии С2С12, выделяющих нейротрофические факторы (CNTF).

Имплантация в ЦНС «новой ткани»

Ученые из университета Корнелла (Cornell University (New York, NY)) разработали метод трансплантации, позволяющий контролировать выживание и дифференцировку клеток фетального головного мозга при помощи предварительной сборки «новой ткани», в которой соединены фетальные клетки, элементы синтетического матрикса и контролируемо выделяющиеся белки, что имитирует микроокружение в развивающейся ткани (Mahoney and Saltzman 2001). Процедура начинается с ферментативного разделения клеток крысиного фетального головного мозга, в результате чего получается смесь дифференцированных клеток, напоминающих нейроны и глиальные клетки. На отдельном этапе из полимера (лактид-ко-гликолид (lactide-co-glycolide)) производят микрочастицы, в которых заключены фактор роста нервной ткани (NGF) и вещества, регулирующие его выделение. Суспендированные клетки и эти микрочастицы инкубируют вместе в ротационном шейкере, так что благодаря силам неспецифического электростатического взаимодействия между гликокаликсом клеток и поверхностью микрочастиц они слипаются в смешанные агрегаты. Получившуюся «новую ткань» трансплантировали в головной мозг здоровых взрослых крыс. Трансплантированные клетки и микрочастицы оставались в месте трансплантации. Впоследствии при исследовании срезов ткани головного мозга было показано увеличение содержания NGF в течение первых 7 дней с последующим снижением через 21 день. Концентрация холинацетилтрансферазы оставалась повышенной в течение 21 дня, показывая, что синтетические микрочастицы продолжают выделять биологически активный NGF в достаточном для поддержания выживания и дифференцировки холинэргических клеток количестве. Одно из возможных приложений такой технологии – направлять воздействие микрочастиц на популяции специфических клеток в «новой ткани». Например, можно покрыть микрочастицы н-кадхерином (n-cadherin), чтобы направить источник NGF к нейронам. Микрочастицы могут сочетать выделение специальных веществ, способствующих отдельным аспектам функционирования трансплантированных клеток, например, направляющих рост аксонов, передающих внеклеточные сигналы или модифицирующие иммунный ответ. Таким образом можно будет сделать специальные «новые ткани» для лечения нейродегенеративных заболеваний и повреждений спинного мозга.

Введение клеток в ЦНС при помощи катетеров

Эффективность действия нейротрофических факторов может быть значительно повышена при введении их в конкретные регионы мозга при помощи продуцирующих их клеток; таким образом удается избежать токсичности, связанной с системным введением высоких доз. Клетки могут быть введены в нужное место при помощи иглы или катетера под контролем аппаратной визуализации. Компания BresaGen Inc в сотрудничестве с Image-Guided Neurologics выпускает и продает специализированные катетеры, предназначенные для введения клеток к головной мозг. Такая процедура потенциально может применяться для лечения неврологических заболеваний, в том числе болезни Паркинсона.

Внутривенное введение

Согласно результатам исследований, внутривенно введенные мыши клетки костного мозга способны развиваться в клетки ЦНС и экспрессировать нейрональные белки (Brazelton et al 2000). Ученые получали взрослые клетки костного мозга от трансгенной мыши, которые экспрессировали ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Костный мозг внутривенно вводился летально облученной взрослой мыши. Через несколько месяцев после трансплантации исследователи обнаружили меченые GFP клетки «по всей ЦНС, включая обонятельные луковицы, гиппокамп, кортикальные области и мозжечок». Дальнейший анализ отдельных клеток методом конфокальной микроскопии показал, что на срезах головного мозга сотни клеток донорского происхождения экспрессировали продукты генов, специфичные для нейронов. Донорские клетки были интегрированы в свое нейральное окружение. В донорских клетках также была обнаружена способность фосфорилировать фактор транскрипции CREB, компонент большого сигнального пути трансдукции нейронов. Авторы считают, что такие факторы, как возраст донора и реципиента, тип повреждений, период времени после трансплантации и доступность специфических трофических факторов могут влиять на частоту продукции нейроноподобных клеток из донорских клеток костного мозга. Эти открытия могут найти применение в клинике. Из этих клеток можно не только получить интегрирующиеся в мозг нейроны, но и после генетической модификации они могут применяться в качестве инструмента для лечения болезней, характеризующихся недостаточностью нейрональных функций или утратой нейронов, например, болезни Паркинсона, лизосомных болезней накопления, психиатрических расстройств, травм и других видов повреждений ЦНС.
Один из изучающихся в настоящее время методов переноса генов – клеточная генная терапия. Эта технология включает генетические манипуляции с клетками после их размножения in vitro и последующее введение их в соответствующие ткани. В генной терапии болезней человека успех метода клеточной генной терапии зависит от способности клеток пролиферировать на стадии амплификации in vitro. Одно из ограничений для применения метода – феномен старения диплоидных клеток после определенного числа делений. Для клеточной генной терапии может быть использовано несколько типов клеток: фибробласты, миобласты, кератиноциты, гепатоциты, нервные клетки и т.д. Чаще всего используют фибробласты. В настоящее время исследуется возможность применения стволовых клеток.

Клетки, применяемые для генной терапии неврологических заболеваний

Исследователи используют новые методы для идентификации генов, избирательно экспрессирующихся стволовыми клетками ЦНС. Затем важное значение этих генов в процессах восстановления ЦНС может быть подтверждено либо путем помещения их в стволовые клетки, линии клеток или непосредственно в мозг, либо посредством имитации или подавления их функций при помощи специфических фармакологических вмешательств.
Одна из стратегий, которые могут применяться в генной терапии неврологических заболеваний, например, болезни Паркинсона, - использование генетически модифицированных вне организма клеток. Предполагается, что идеальными кандидатами для реализации работы терапевтических генов должны быть клетки, происходящие из головного мозга, поскольку они могут сливаться с клетками мозга реципиента и экспрессировать трансгены в течение долгого времени. В качестве питающих и поддерживающих ткань мозга клеток
Go to the top of the page
 
+Quote Post

Reply to this topicStart new topic
1 чел. читают эту тему (гостей: 1, скрытых пользователей: 0)
Пользователей: 0

 



Текстовая версия Сейчас: 04.12.2020, 7:31